آماده سازی محیط کشت
انتخاب محیط کشت:
اکثر محیط های کشت دارای آگار معمولاً به صورت پودرهای محلولی در دسترس هستند
که حاوی مواد غذایی مورد نیاز هستند. فرمول ساخت معمولا بر روی برچسب ظرف مربوطه درج می شود.این پودر با آب مقطر مخلوط و استریلیزه می شود.با این وجود بیشتر محیط های کشت را می توان به سادگی در آزمایشگاه تهیه نمود.چند مورد از این نسحه ها (فرمول ها) در زیر به آن اشاره شده است.
برخی محیط های کشت عنی از مواد غذایی نیستند در حالی که برخی بر عکس سرشار از مواد مغذی هستند.عموماً محیط های کشت فقیر بیشتر توصیه می شوند چرا که فرآیند رشد را زیاد تحریک نمی کنند و به همین دلیل برخی قارچهایی که دارای فرآیند کندی هستند مغلوب دیگر قارجهای سریع الرشد نمی شوند. همچنین انازه گیری ها( ابعاد) برخی قارچها در محیط کشت های فقیر نزدیکتر به حالت و شرایط واقعی آنها در طبیعت نزدیگتر است. دو مورد از این نوع محیط کشت های فقز عبارتند از آب – آگار و آگار- سیب زمینی هویج.
آنتی بیوتیکها را می توان برای جلوگیری از رشد باکتری ها به محیط کشت اضافه کرد. این آنتی بیوتیکها معمولا در اولین کشت (قارجها) و نیز برای خالص کردن محیط های کشتی که به باکتریها آلوده شده اند استفاده می شود. برخی آنتی بیوتیکهای مفید عبارتند Chloramphenicol، Novobiocin و تترامایسین (Tetramycin). این آنتی بیوتیکها به تنهایی یا ترکیبات مختلف معمولا در علظت های ml/l5 استفاده می شوند.آنتی بیوتیکها توسط یک سرنگ تنها بعد از استریلیزاسیون و وقتی که آگار سرد و به دمای 48-45 درجه سانتی گراد رسیده است به محیط کشت اضافه می شوند.
هر قارچ نیاز غذایی خاص خود را دارد. قارجهای مختلف و حتی ایزوله های مختلف یک گونه نیز اغلب دارای نیازهای خاص هستند. به همین دلیل است گه برخی از از محیط های کشت آگار معین، برای مطالعه بهتر رشد برخی از قارجها از بقیه بهتر هستند محیط های کشت خاصی برای قارجهای مشخصی تهیه شده است، این محیط کشت ها به عنوان محیط کشت حاص یا انتخابی شناخته می شوند.چنین محیط کشت هایی برای مطالعه مقایسه ای و تعیین اعضای بسیاری از جنس ها شامل فوزاریوم، اسپرژیلوس و پنی سیلیوم مورد نیاز هستند.
شرایط آماده سازی موفقیت آمیز محیط کشت
جلوگیری از آلودگی از جمله پر اهمیت ترین مسائل در هنگام آماده سازی محیط کشت است ( یعنی بصورت ...کار کنید).
· محیط کشت و .....استریل شده و سرد استفاده کنید همچنین در زمان لازم از آب مقطر استفاده کنید.
· همواره از اتیل الکل ( حداقل 70%) استفاده کنید تا سطحی را که می خواهید کار کنید با آن پاک کنید.
· در محیط خشک کار نکنید: اسپورها توسط جریان هواحمل می شوند
· آگاری که نیاز به استریل کردن دارد باید درون بطریهایی درب دار قرار داده شود. برخی فلاسکها مثل اهرلن مایر که دارای محافظ های پنبه-پشم هستند نیز مناسبند.
· نوع محیط کشت را باید بر روی ظرف آن با قلمی که جوهر آن پاک نشود نوشته شود.
· ظرفی که آگار در آن استریل می شود نباید بطور کامل پر شود چرا که محتویات آن بیرون می ریزد( حجم آگار هنگامی که محیط کشت گرم می شود یا در اتوکلاو یا تحت فشار قرار می گیرد افزایش می یابد).
· درب بطری را قبل از قرار در اتوکلاو به اندازه یک چهارم باز کنیم. بعد از استریلیزاسیون و قبل از سرد شدن درب را ببندید.
پتری دیش ها، لوله های تست و بطری های مک کارتنی نیز باید بطور شفاف نام محیط کشت داخل آنها ذکر شود (مثل WA، PCA وغیره).
استریلیزاسیون
وسائل را می توان توسط روشهای مرطوب یا خشک استریل نمود.
استریلیزاسیون مرطوب (تر)
استریلیزاسیون مرطوب برای محیط کشت و مواد گیاهی استفاده می شود. اقلام مورد نظر را به مدات 15 دقیقه در دمای 121 درجه سانتی گراد در فشار p.s.i در یک اتوکلاو یا دستگاه دیکر (فشار دار) گرما داده می شوند. تمامی محیط کشت های آگار دار به این روش استریل می شود.
استریلیزاسیون خشک
استریلیزاسیون خشک برای ابزارهای شیشه ای مثل پیپت هاف پتری دیش های شیشه ای و غیره استفاده می شود. ابزار مربوطه در ظرف مناسبی گردآوری شده و گرما داده می شود، گرما دادن به مدت 1-2 ساعت در 160 درجه سانتی گراد برای استریل شدن گافی می باشد.
نکته: یک اوون مایکروویو نمی توان عمل استریل کردن را انجام دهد. اگر چه این دستگاه گرما می دهد اما فشار مورد نیاز ایجاد نمی شود. از این حالت فقط برای استریل کردن مقدار کمی آگار مناسب است. به خاطر داشته باشید که آگار دارای نقطه جوش بالایی است و در صورت سرریز شدن سوختگی ایجاد می نماید.
ریختن آگار درون ظرفهای مختلف
پتری دیش ها
یک طرف درب پتری دیش را با دقت بلند نمایید فقز به اندازه ای که بتوانید آگار را درون پتری دیش بریزید. درب پتری رت کاملا بر ندارید آن را بر روی سطح کار یا زمین قرار ندهید. پتری دیش های پلاستیکی را نمی توان به روش های خشک یا تر استریل نمود.این ظروف به صورت استریل خریداری می شوند و تنها در صورتی می توان از آنها مجدداً استفاده نمود که توسط اشعه استریل شود. چنانچه این امکان برای استریل کردن آنها وجود نداشته باشد بایستی بعد از استفاده به دور انداخته شود.پتری های شیشه ای باید قبل از ریخته شدن آگار به درون آنها استریل شوند. بایست آنها را درون ظرف مناسب بسته یا پوشش دار (فویل آلومینیم) قرار داده شود و سپس استریل شود. می توان آنها را بصورت خشک یا تر استریل شود.استریلیزاسیون خشک ترجیح داده می شود چرا که به مدت طولانی تری استریل می مانند.
بطری های مک کارتنی
سوسپانسیون آگار و آب تا هنگامی ج.شانده می شود که آگار بطور صحیح حل شود. متناوباً می توان آنها ار برای یک دوره در اتوکلاو قرار داد. سپس با دقت پس از اینکه کمی سرد شد درون بطری ها ریخته می شود، مخلوط را هر بار قبل از ریختن آن به هم بزنید.
درب بطری ها بایست یک چهارم باز شوند و سپس برای استریل شدن درون اتوکلاو قرار داده شوند. بعد از استریلیزاسیون درب بطری ها بطور صحیح بسته می شوند.بطری ها سپس با زوایه ( مقداری کج) قرار داده می شود تا آگار سرد شود.
لوله های تست
لوله های تست به همان روش پر کردن بطری های مک کارتنی می باشد. چوب پنبه های پشمی بیشتر توصیه می شود. تیوب ها باید در سبدهای سیمی قرارداده شود و جهت قرار گرفتن چوب پنبه ها بایست دقت شود. بالای سبد با فویل آلومینیم یا یک پاکت کاغذی پوشیده می شود. بعد از استریلیزاسیون لوله های تست بصورت زاویه ای قرار داده می شوند و سپس اجازه داده می شود تا سرد شود.
نکته: هنگام استفاده از مایعات قابل اشتعال ، ابزار داغ و آگار گرم یا دیگر مواد مورد نیاز ساخت محیط کشت که خطر آفرین هستند، احتیاط کنید. آگار استریل شده بید اجازه داده شود تا سرد شود و به دمای 48-45 درجه قبل از ریحتن برسد. آنتی بیوتیکها را بایست دقیقا قبل از ریختن آگار اضافه نمود.
فرمول محیط های کشت مشهور
نکته: PDA، OMA و MEA از محیط کشت های غنی از مواد غذایی هستند.PCA و WA از محیط کشت های فقیر هستند. بسته به نوع آگار(مرغوبیت) می توان 20-10 گرم آگار در لیتر استفاده نمود. هر چه میزان آگار بیشتر باشد محیط کشت سفت تر می شود.
محیط کشت آب آگار (WA)
آگار : 15 گرم
آب : یک لیتر
روش: 1- آگار را درون آب حل کنید. 2- به مدت 15 دقیقه استریل کنید( p.s.i15 در 121 درجه سانتی گراد)
عصاره مالت آگار، 2% ( MEA)
عصاره مالت( مثل ِdifco و غیره) 20 گرم
آگار : 15 گرم
آب : یک لیتر
روش: 1- عصاره مالت را در آب تا حل شدن آن بجوشانید 2- آگار را اضافه نمایید.3- بصورتی که قبلا عنوان شد استریل کنید.
آگار- جوی دوسر (OMA)
جوی دو سر( له شده یا نرم شده)- 30 گرم
آگار : 15 گرم
آب : یک لیتر
روش:
1- جوی دو سر را در آب به مدت یک ساعت بجوشانید و هم بزنید 2- از الک آن را رد کنید ( یا پارچه ای دیگر بسته به میزان شفافیت محیط کشت مورد نیاز) 3- میزان آب را تا 1 لیتر اضافه کنید و آگاررا اضافه کنید و تا حل شدن آن بجوشانید. 4- استریل کنید
سیب زمینی آگار (دکستروز آگار) PDA
سیب زمینی 200 گرم
دکستروز 20 گرم
آگار 20 گرم
آب یگ لیتر
روش:
1- سیب زمینی را خرد و رنده کیند اما پوست آن را نکنید
2- آن را وزن کنید و در یک لیتر آب تا نرم شدن آن بجوشانیذ.
3- از طریق یک الک آنها را بفشارید (چلاندن)
4- آگار را اضافه کنید و تا حل شدن آن بجوشانید
5- حجم را به یک لیتر برسانید.
نکته: برای فوزاریوم از قند ساکاروز به جای دکستروز (یعنی PSA ) استفاده کنید، اسیدیته را در 6.5 تنظیم کنید.
سیب زمینی هویج آگار(PCA)
سیب زمینی رنده شده یا ریز شده- 20 گرم
هویج رنده شده یا ریز شده- 20 گرم
آگار 20 گرم
آب یک لیتر
روش:
1- سبزیحات را در آب به مدت یک ساعت بجوشانید.
2- از پارچه الک رد نمایید . آگار اضافه نمایید.
3- آنقدر بجوشانید تا آگار حل شود.
4- بصورت های کفته شده استریل نمایید.
